股骨近端微量元素Zn与骨形态发生蛋白7及Stro-1+细胞的相关性：预测髋关节假体寿命

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.44.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：假体周围微量元素Zn的含量与骨形态发生蛋白7、Stro-1⁺细胞相关性可能影响髋关节假体的骨融合与生存率。

目的：分析股骨近端微量元素Zn与骨形态发生蛋白7、Stro-1⁺细胞的相关性。

方法：24例初次髋关节置换患者，取术中股骨矩开槽时废弃骨块，提取细胞后体外培养骨髓间充质干细胞。培养14 d采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞中的Stro-1⁺细胞，酶联免疫吸附测定试剂盒检测培养细胞离心上清液中骨形态发生蛋白7的表达，放射免疫荧光法检测培养细胞离心上清液中Zn含量。

结果与结论：Zn含量在不同年龄组及不同性别组差异无显著性意义；Zn与Stro-1⁺、骨形态发生蛋白7正相关联系。关于股骨近端微量元素Zn的进一步研究可以用来预测和干预髋关节假体的寿命。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

全文链接：

关键词: 植入物, 人工假体, 髋关节置换, 骨重建, 锌, 骨髓间充质干细胞, 骨形态发生蛋白7

Abstract:

BACKGROUND: The correlation of zinc with Stro-1⁺ cells and bone morphogenetic protein 7 surrounding the prosthesis may affect the bone fusion and survival rate in hip prosthesis.

OBJECTIVE: To analyze the correlation of zinc content with Stro-1⁺ cells and bone morphogenetic protein 7 in proximal femur.

METHODS: Bone samples were obtained from the discarded metaphysis region of the proximal femur in 24 patients with primary total hip replacement. Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in vitro. At 14 days after culture, Stro-1⁺ cells in bone marrow mesenchymal stem cells were detected using flow cytometry. Bone morphogenetic protein 7 expression in cell supernatant was detected using enzyme-linked immunosorbent assay. Zinc content in supernatant was measured using radio-immunity assay.

RESULTS AND CONCLUSION: No significant difference in the zinc content was detected in different age groups and different gender groups. Zinc content was positively associated with Stro-1⁺ cells and bone morphogenetic protein 7 expression. The further study of the trace element zinc in proximal femur can predict and intervene the longevity of hip prosthesis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

全文链接：

Key words: joint replacement, hip, bone marrow mesenchymal stem cells, bone morphogenetic protein 7

中图分类号:

R318

傅晓东，王伟力，沈奕，李晓淼. 股骨近端微量元素Zn与骨形态发生蛋白7及Stro-1⁺细胞的相关性：预测髋关节假体寿命[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(44): 7061-7065.

Fu Xiao-dong, Wang Wei-li, Shen Yi, Li Xiao-miao. Correlation of trace element zinc with bone morphogenetic protein 7 and Stro-1⁺ cells in proximal femur: predicting hip prosthesis life[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(44): 7061-7065.

图/表（结果） 3

参考文献

[1]Caton JH, Prudhon JL,Ferreira A,et al. A comparative and retrospective study of three hundred and twenty primary Charnley type hip replacements with a minimum follow up of ten years to assess wether a dual mobility cup has a decreased dislocation risk.Int Orthop. 2014;38(6):1125-1129.
[2]Berry DJ, Harmsen WS, Cabanela ME,et al.Twenty-five-year survivorship of two thousand consecutive primary Charnley total hip replacements: factors affecting survivorship of acetabular and femoral components.J Bone Joint Surg Am. 2002;84-A(2):171-177.
[3]Bidwell JP, Alvarez MB, Hood M Jr, et al.Functional impairment of bone formation in the pathogenesis of osteoporosis: the bone marrow regenerative competence. Curr Osteoporos Rep. 2013;11(2):117-125.
[4]Zhang L, Peng LP, Wu N, et al.Development of bone marrow mesenchymal stem cell culture in vitro. Chin Med J (Engl). 2012;125(9):1650-1655.
[5]Persani L, Rossetti R, Di Pasquale E, et al.The fundamental role of bone morphogenetic protein 15 in ovarian function and its involvement in female fertility disorders. Hum Reprod Update. 2014 Jun 30. pii: dmu036.
[6]商亚徽,赵宝红.锌对成骨细胞生物学作用研究进展[J].中国实用口腔科杂志,2013,6(10):629-633.
[7]Qiao Y, Zhang W, Tian P, et al.Stimulation of bone growth following zinc incorporation into biomaterials. 2014;35(25): 6882-6897.
[8]Luo X, Barbieri D, Davison N, et al.Zinc in calcium phosphate mediates bone induction: in vitro and in vivo model.Acta Biomater. 2014;10(1):477-485.
[9]沈奕,李晓淼,傅晓东,等,股骨近端Stro-1+细胞与骨形态发生蛋白及其受体的相关性[J].中国组织工程研究, 2012,16(45) : 8380-8384.
[10]Vignon E, Valat JP, Rossignol M, et al. Osteoarthritis of the knee and hip and activity: a systematic international review and synthesis (OASIS).Joint Bone Spine. 2006;73(4): 442-455.
[11]Caviglia HA1, Osorio PQ, Comando D.Classification and diagnosis of intracapsular fractures of the proximal femur. Clin Orthop Relat Res. 2002;(399):17-27.
[12]柳向东,柴冈,李东,等,成人骨髓间充值干细胞的体外培养和表型鉴定[J].上海第二医科大学学报,2004,4(24):300-301.
[13]Mäkelä KT, Matilainen M, Pulkkinen P, et al. Countrywise results of total hip replacement. An analysis of 438,733 hips based on the Nordic ArthroplastyRegister Association database.Acta Orthop. 2014;85(2):107-116.
[14]Lombardi AV Jr.Case studies in management of THA failure secondary to taper corrosion, modular junctions and metal-on-metal bearings.J Arthroplasty. 2014;29(4):663-667.
[15]French TH, Russell N, Pillai A..The diagnostic accuracy of radionuclide arthrography for prosthetic loosening in hipand knee arthroplasty.Biomed Res Int. 2013;2013:693436.
[16]Prokopetz JJ, Losina E, Bliss RL, et al.Risk factors for revision of primary total hip arthroplasty: a systematic review.BMC Musculoskelet Disord. 2012;13:251.
[17]Ruetze M, Richter W.Adipose-derived stromal cells for osteoarticular repair: trophic function versus stem cell activity.Expert Rev Mol Med. 2014;16:e9.
[18]Bianco P, Kuznetsov SA, Riminucci M, et al. Postnatal skeletal stem cells. Methods Enzymol 2006; 419:117-148.
[19]Kim IS, Song YM, Cho TH, et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Dev Growth Differ 2008; 50: 553-564.
[20]Boden SD.The ABCs of BMPs. Orthop Nurs. 2005;24(1): 49-52; quiz 53-4.
[21]Otto WR, Rao J.Tomorrow's skeleton staff: mesenchymal stem cells and the repair of bone and cartilage. Cell Prolif. 2004;37(1):97-110.
[22]Chen D, Zhao M, Mundy GR.Bone morphogenetic proteins. Growth Factors. 2004;22(4):233-241.
[23]Wan M, Cao X.BMP signaling in skeletal development. Biochem Biophys Res Commun. 2005;328(3):651-657.
[24]Lee JT, Jung JW, Choi JY, et al.Enhanced bone morphogenic protein adenoviral gene delivery to bone marrow stromal cells using magnetic nanoparticle.J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg. 2013;39(3):112-119.
[25]Glynn ER, Londono AS, Zinn SA, et al.Culture conditions for equine bone marrow mesenchymal stem cells and expression of key transcription factors during their differentiation into osteoblasts.J Anim Sci Biotechnol. 2013;4(1):40.
[26]Kaigler D, Krebsbach PH, West ER, et al.Endothelial cell modulation of bone marrow stromal cell osteogenicpotential. FASEB J. 2005;19(6):665-667.
[27]Wang C, Wang X, Xu XL, et al.Bone microstructure and regional distribution of osteoblast and osteoclast activity in the osteonecrotic femoral head.PLoS One. 2014;9(5):e96361.
[28]Nam J, Perera P, Rath B, et al.Dynamic regulation of bone morphogenetic proteins in engineered osteochondral constructs by biomechanical stimulation.Tissue Eng Part A. 2013;19(5-6):783-792.
[29]Alam N, St-Arnaud R, Lauzier D, et al.Are endogenous BMPs necessary for bone healing during distraction osteogenesis? Clin Orthop Relat es.2009;467(12):3190-3198.
[30]Friedlaender GE, Perry CR, Cole JD, et al.Osteogenic protein-1 (bone morphogenetic protein-7) in the treatment of tibialnonunions.J Bone Joint Surg Am. 2001; 83-A Suppl 1 S151-S158.
[31]Nishi Y.Zinc and growth.J Am CollNutr. 1996;15(4):340-344.
[32]Yamaguchi M, Uchiyama S. Receptor activator of NF-kappaB ligand-stimulated osteoclastogenesis in mouse marrow culture is suppressed by zinc in vitro.IntJ Mol Med. 2004;(1): 81-85.
[33]Yamaguchi M, Uchiyama S.Combination of beta-cryptoxanthin and zinc has potent effects on apoptotic cell death and suppression of bone resorption-related gene expression in osteoclasticcells.Int J Mol Med. 2008;22(2): 221-228.

引言

国内外人工关节置换尤其髋关节置换已日益普及，国内很多县区级医院已广泛开展此类手术，因此假体松动翻修术的病例也随之增多^[1-2]。假体翻修手术带给患者痛苦，增加了医疗支出，如何提高假体骨融合、延长假体生存率成为关节外科的研究热点。现有的研究多着眼于假体设计、固定方式以及磨损微粒方面，而缺乏考虑患者本身的因素。本实验将基于此，尝试从一个新的视角出发来寻找一种预测髋关节置换术后假体生存率的实验室指标。 STRO-1是人类骨髓细胞的表面抗原，Stro-1⁺间充质干细胞具有很强的成骨分化能力。Stro-1⁺丰富的骨髓间充质干细胞亚群细胞有较强的间质分化能力，如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞^[3]。有诸多因素可能导致个体间Stro-1⁺细胞的差异，如年龄、性别等因素^[4]。

骨形态发生蛋白是一种能够通过诱导成骨修复骨缺损的生物因子，是一类生长分化因子家族，作用具有浓度依赖性，与相应感受器结合会产生一系列骨形态发生蛋白反应基因的信号表达和转录，诱导间质细胞分化为骨或软骨。骨形态发生蛋白7是骨形态发生蛋白家族中的一员，主要在骨、肾组织中表达，与胚胎组织的发育、功能维持及组织的修复均密切相关，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表达^[5]。实验证实骨形态发生蛋白7可以引导骨髓间充质干细胞向成骨细胞转换。

锌是维持机体正常生理功能以及稳定内环境中不可或缺的微量元素，在骨代谢过程中，锌也扮演了重要角色，锌是多种骨代谢酶(如碱性磷酸酶、胶原酶)的重要辅助因子，它们作为骨基质的成分参与骨代谢^[6]，微量元素锌与成骨密切相关^[7-8]。

在作者之前已完成的研究中已证实Stro-1⁺细胞、骨形态发生蛋白7含量在不同年龄组有轻微差异，但无统计学意义^[9]；Stro-1⁺、骨形态发生蛋白7含量在不同性别组差异无统计学意义^[9]。本实验以此为切入点，研究假体周围微量元素锌的含量与骨形态发生蛋白7、Stro-1⁺细胞相关性，为髋关节假体的骨融合与生存率研究提供新视野。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年7月至2013年7月在上海市仁济医院完成。

对象：选取2012年7月至2013年7月上海市仁济医院收治的初次接受全髋关节置换患者24例，男12例，女12例；年龄52-86岁(平均66.7岁)；体质量指数21.5-40(平均29.2) kg/m²。

患者纳入标准： ①骨关节炎及股骨颈骨折接受全髋关节置换患者^[10-11]。②年龄在50-90岁。③有标准的骨盆平片及股骨全长正侧位片。

排除标准： ①类风湿关节炎及其他自身免疫性疾病的患者。②在髋关节置换前2周接受过非类固醇类镇痛药物、类固醇激素、雌激素替代疗法、二膦酸盐化合物以及钙剂治疗的患者。③髋关节置换后出现并发症，包括感染、假体置入失败、创伤愈合问题以及血管、神经的损伤者。

手术的标准化：为了将手术对本研究结果的影响降到最小，髋关节置换手术将由同一位医师及其带领的团队完成，采用同一手术入路(后外侧切口)，取术中股骨矩开槽时废弃骨块，体积为2 cm³，在实验前均获得患者知情同意并签字。

方法:

骨髓间充质干细胞的体外培养： ①髋关节置换中取出股骨近端开槽后废弃的骨块，放入无菌的培养液中，1 h内送实验室。②骨块加入5 mL HBSS后洗涤2次后离心(200×g, 10 min, RT)，取上清液-80 ℃保存。提取细胞后在加入5 mL α-MEM/体积分数20%胎牛血清(Thermo Hyclone FBS #SH30070-03,lot#ATB31457)的T75瓶子中培养。营养液由α-MEM、谷氨酰胺、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 mg/L)以及体积分数20%胎牛血清组成。③每周更换3次培养液，观察细胞生长情况，显微镜下达到50%分布后分瓶(一般需4-10 d)，对生长情况不佳的标本予以剔除。④培养至5×10⁵/T75后流式细胞仪检测Stro1⁺细胞(即代表具有向成骨细胞分化功能的细胞数)的总数量(个/mL)，所有标本要求在体外培养同样天数，把培养时间定为14 d。

骨髓间充质干细胞鉴定：通过骨髓间充质干细胞进行细胞表面标志的检测及细胞周期检测鉴定^[12]。

流式细胞检测Stro-1⁺细胞：骨髓间充质干细胞悬液在4 ℃与单抗共同培育1 h，然后用PBS冲洗未结合抗体。单克隆抗体结合异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE)或异藻蓝蛋白(APC)检测Stro-1⁺。经过标记、洗涤，细胞用Becton Dickinson流式细胞仪检测。每个样本至少检测10⁴个细胞，应用细胞检测软件分析，Stro-1⁺细胞采用了绝对计数法计数。

酶联免疫分析(ELISA)：通过酶联免疫吸附测定试剂盒检测培养细胞离心上清液中骨形态发生蛋白7的表达。

放射免疫荧光法(RIA)：通过放射免疫荧光法检测培养细胞离心上清液中Zn。

主要观察指标： ①股骨近端骨块体外分离培养的细胞Stro-1⁺细胞数量。②体外分离培养的细胞离心上清液中骨形态发生蛋白7和Zn含量。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件分析，采用Pearson相关系数进行相关性分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

全文链接：

讨论

髋关节置换是最常用的成人关节重建手术之一，是目前治疗严重骨性关节炎、类风湿性关节炎、股骨头无菌性坏死、股骨颈骨折等髋部疾病行之有效的方法。随着手术技术的不断提高以及围手术期处理的不断规范化，感染、髋关节脱位、坐骨神经损伤等手术后近期并发症的发生率已明显下降，由于假体制造工艺、生物力学、患者个体骨重建能力等诸多因素的影响，假体松动等远期并发症仍有较高的发生率^[13-14]。其中假体松动是最严重的并发症，是造成假体失败的主要原因及翻修手术的最常见原因^[15-16]。以往的研究多针对假体设计、固定方式以及磨损微粒等方面，而缺乏考虑患者本身的因素。本实验从患者的个体因素出发，研究探寻可能的影响因素，提供一些相应的实验室手段来帮助骨科医生对患者关节置换手术的预后进行较为有依据的判断，以期早期进行干预治疗。现有研究表明髋关节置换后假体的稳定性以及长期生存率主要依靠假体周围的早期和有效的骨重建。这个过程需要假体周围拥有足够数量的，并具有向成骨细胞成功分化的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞分化的成骨细胞多则成骨作用强^[17]，而Stro-1⁺是骨髓间充质干细胞的生物学标记，代表了骨髓间充质干细胞的成骨潜能^[18-19]。

骨形态发生蛋白，除骨形态发生蛋白1外其余均属于转化生长因子β超家族。骨形态发生蛋白是低相对分子质量(约30 000)、不含胶原的糖蛋白, 成熟骨形态发生蛋白分子是由一个依赖半胱氨酸二硫键固定的双链(每链含有400个氨基酸)多肽二聚体分子，而且重要的结构40%-50%与转化生长因子β高度同源^[20-21]。骨形态发生蛋白是以一个大的前体蛋白的形式合成的，包括信号肽部分、前结构域和羧基末端区，蛋白水解酶将羧基末端从前体蛋白切割下来后即形成二聚体^[22]。二聚体是骨形态发生蛋白活性形式, 骨形态发生蛋白既可以2个相同的链形成的同源二聚体起作用，也可以2个不同的链形成的异源二聚体起作用。骨形态发生蛋白7是骨形态发生蛋白家族中的一员，主要在骨、肾组织中表达，与胚胎组织的发育、功能维持及组织的修复均密切相关，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表达^[23]。在成骨过程中，间充质干细胞首先分化为前成骨细胞，再分化为成骨细胞，骨形成蛋白中的骨形成蛋白7，在诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化、促进髋关节假体周围骨融合重建的过程中发挥的调节作用已越来越引起重视^[24-25]，同时它也参与了骨平衡^[26]，近年大量临床研究证明关节置换患者其骨髓内骨髓间充质干细胞数量，骨形态发生蛋白含量有很大的个体差异，而且骨髓间充质干细胞对骨形态发生蛋白7促进骨融合重建的反应不一^[27-28]，原因目前尚在研究，这种骨髓间充质干细胞对骨形态发生蛋白7的反应差异最可能的原因是患者的个体差异，例如性别、年龄、体质量指数以及其他基础疾病等^[29]。因此，美国FDA批准仅在严格掌握适应证的情况下使用人重组骨形态发生蛋白7用于手术过程中^[30]，以协助骨修复。

锌是维持机体正常生理功能以及稳定内环境中不可或缺的微量元素，骨组织在一生中不断更新代谢，机体缺锌可导致骨代谢异常。在骨代谢过程中，锌扮演了重要角色，锌是多种骨代谢酶(如碱性磷酸酶、胶原酶)的重要辅助因子，它们作为骨基质的成分参与骨代谢。既往研究显示，锌能有效的增加成骨细胞的吸附和碱性磷酸酶的活性，促进骨细胞在成骨过程中的表达，促进前成骨细胞分化、矿化的作用。动物在妊娠期锌缺乏可引起子代骨骼异常，有动物实验报道幼罗猴饲以临界性锌缺乏饲料，其结果与饲以正常对照饲料组相比钙化不完全^[31]，骨骺中心出现迟缓，从骨X射线片可见骨皮质变薄、骨密度降低，骨外型的表现与维生素D3缺乏所致骨钙化障碍相似，生长板变薄增宽，有微弱的暂时性钙化，所不同的是缺锌后血钙未降低，但骨钙含量降低。母体锌缺乏也可以引起胚胎骨生长板功能及结构异常，软骨细胞酶活性降低，软骨内成骨障碍。同时，体外实验证明锌能抑制破骨细胞的活性及分化，干扰抑制骨吸收^[32]。然而，在另一些动物实验中，当锌含量超过最佳成骨刺激值后，骨外形变短、变薄，组织学观察发现成骨细胞的数量随着培养时间的延长而减少，继续提高锌浓度，甚至会出现胞浆肿胀、细胞核扩大和苍核，有些细胞融合，分化成破骨细胞，甚至细胞出现坏死。上述实验表明，锌为骨生长发育所需，过量则对骨细胞产生毒性作用，锌缺失和锌过量都会影响骨生长和代谢^[33]，因此，本课题选择微量元素锌作为研究的切入点。

为了避免采集标本量误差，作者在收集股骨近端时用同样体积2 cm³的骨块，因此Zn含量的差别可以反映标本的个体差异。24例标本Zn数值个体差异较大，在男性患者中的含量较女性患者略低，但无统计学意义。70岁以下组中Zn量较70岁以上组略低，同样也无统计学意义。在所取骨块体积量相等的前提下，这些结论有助于排除不同年龄及不同性别对研究结果的干扰。本实验中发现，股骨近端Zn含量与Stro-1⁺数量及骨形态发生蛋白7浓度正相关联系。依据迅之前的研究结果Stro-1⁺、骨形态发生蛋白7可反应假体周围的成骨能力，股骨近端Zn含量影响骨融合与骨形成。但从另一方面来说，依据之前提到的动物实验已证明，锌缺失和锌过量都会影响骨生长和代谢，目前的研究无法提示假体周围的锌位于何种浓度区间时产生对假体周围骨融合及骨重建的正向调节作用，低于或者高于这个浓度区间会对骨融合及骨重建产生负向调节作用。虽然目前无法确定这个正向调节所需的锌浓度区间，可能需要进一步的动物模型或者离体实验来研究证实，但是相信，随着之后研究的深入，骨科医生可以通过对初次手术采集的标本的中锌浓度的检测来预测关节置换患者的局部骨形成能力，从而尽早能制定个体化的干预治疗方法，尽量避免如常规摄片难以发现早期或潜在的假体松动而贻误干预时机，避免患者遭受假体松动带来的痛苦及翻修手术带来的社会经济损失。同时，可以期待如果适合的锌浓度区间在之后的研究中被定义，它也可以反过来提示可以某种手段例如在目前假体植入界面羟基磷灰石中添加合适剂量锌的缓释粒子来达到这一浓度区间，提高关节置换患者的局部骨形成能力，延长假体的预期使用寿命，而这些正是本研究的意义所在，也有待于进一步研究证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
全文链接：